Vienuoliktas skyrius. Horizontalus transgeninės DNR perkėlimas

Eksperimentai, įrodantys horizontalaus transgeninės DNR perkėlimo galimybę
Horizontalaus transgenų ir atsparumo antibiotikams genų-žymenų perkėlimo iš GM augalų į dirvožemio bakterijas ir grybus galimybė buvo pademonstruota laboratorijoje jau XX a. paskutiniojo dešimtmečio viduryje. Perkelti transgenus į grybus pavyko nesunkiai – auginant grybus kartu su GM augalu, o transgenų perkėlimas į bakterijas pasiektas įterpiant visą DNR iš GM augalo į bakterijų kultūras.

Baigiantis XX a. paskutiniajam dešimtmečiui, atlikti sėkmingi atsparaus kanamicinui geno-žymens perkėlimai į dirvožemio bakteriją Acinetobacter, panaudojant DNR, gautą iš tokių įvairių augalų, kaip Solanum tuberosum (bulvė), Nicotiana tabacum (tabakas), Beta vulgaris (cukrinis runkelis), Brassica napus (aliejiniai rapsai) ir Lycopersicon esculentum (pomidoras) homogenizuotų lapų [108]. Buvo apskaičiuota, kad norint sėkmingai transformuoti vieną bakteriją, pakanka apie 2 500 kanamicinui atsparių genų kopijų (iš to paties skaičiaus augalo ląstelių), nepaisant to, kad augalo DNR buvo 6 x 10⁶ kartų daugiau. Teigiami horizontalaus genų perkėlimo rezultatai šioje sistemoje buvo gauti įterpus į bakteriją vos 100 mikrolitrų sutrinto augalo lapo.

Klaidinimas ir melagingi tvirtinimai

Nuo pat pradžių klaidinimas ir melagingi tvirtinimai ėmė viršų. Nepaisant Schluterio, Futtererio ir Potrykuso mokslinio darbo klaidinančios antraštės, kur teigiama, kad horizontalaus genų perkėlimo tikimybė jų atlikto eksperimento metu „yra labai maža, jei tik iš viso tokia tikimybė yra“ [109], eksperimento rezultatai parodė, kad genų perkėlimo atvejai yra labai dažni, t. y. jų dažnumas yra 5,8 x 10^-2 vienai bakterijai recipientei, esant optimalioms sąlygoms.

Tačiau autoriai tęsė toliau ir apskaičiavo teorinį genų perkėlimo dažnumą, lygų 2,0 x 10^-17, arba artimą nuliui, esant ekstrapoliuotoms „natūralioms sąlygoms“. Tokį rezultatą jie gavo padarę prielaidą, kad skirtingi faktoriai veikia nepriklausomai vienas nuo kito ir išradę „natūralias sąlygas“, kurios yra beveik nežinomos ir nenuspėjamos, ir, kaip pripažįsta patys autoriai, negalima atmesti sinergetinio poveikio, atsirandančio dėl faktorių kombinacijų.

Šis darbas vėliau buvo plačiai cituojamas, kaip pateikiantis įrodymų, kad horizontalus genų perkėlimas nevyksta.

Lauko bandymai pateikia prima facie įrodymus
Jau 1999 m. Vokietijos mokslininkai [110] buvo pranešę apie pirmąjį ir vis dar vienintelį lauko bandymą pasaulyje, kuris pateikė prima facie įrodymų, kad transgeninė DNR perėjo iš GM cukrinių runkelių augalų liekanų į dirvožemio bakterijas. Ho išplatino išsamią šių įrodymų apžvalgą ir deramai pateikė ją Jungtinės Karalystės vyriausybės mokslo patarėjams. Jie atmetė šiuos įrodymus ir, dar blogiau – minėjo juos kaip įrodymus, kad horizontalaus genų perkėlimo nebuvo.

DNR ne tik išlieka išorės aplinkoje – dirvožemyje ir vandenyje, ji nėra suskaidoma virškinimo sistemoje pakankamai greitai, kad būtų užkirstas kelias transgeninės DNR perkėlimui į gyvūnų žarnyne gyvenančius mikroorganizmus.

Transgeninės DNR perkėlimas burnoje
Toks perkėlimas gali prasidėti burnoje. 1999 m. Merceris ir kiti pateikė duomenų [111], kad genetiškai modifikuotos plazmidės tikimybė išgyventi nepažeistai praėjus 60 minučių po to, kai ji buvo paveikta žmogaus seilėmis, sudaro nuo 6 iki 25 %. Be to, iš dalies suskaidyta plazmidinė DNR buvo pajėgi transformuoti Streptococcus gordonii, vieną iš bakterijų, kurios paprastai gyvena žmogaus burnoje ir ryklėje. Šios transformacijos dažnis mažėjo eksponentiškai laiko atžvilgiu, tačiau ir po 10 minučių vis dar buvo didelis. Beje, žmogaus seilėse yra tam tikrų faktorių, kurie skatina burnoje gyvenančių bakterijų transformaciją.

Šis tyrimas buvo atliktas mėgintuvėlyje, ir jo autoriai aiškiai pareiškė, kad „reikalingi tolesni tyrimai, norint nustatyti, ar burnos bakterijų transformacija gali įvykti reikšmingu dažnumu in vivo“. Tačiau nuo to laiko tokie tyrimai nebuvo atliekami, ir tai sunku suvokti, kadangi pirmasis tyrimas, kaip „Naujų maisto produktų programos“ (angl. Novel Foods Programme) dalis, buvo atliekamas Jungtinės Karalystės vyriausybės užsakymu.

Tačiau kita tyrėjų grupė iš Lydso universiteto gavo dotaciją tyrimams iš tada naujai įsteigtos Maisto standartų agentūros (angl. Food Standards Agency, FSA), kad ištirtų horizontalaus genų perkėlimo galimybę atrajojančių gyvūnų skrandžiuose [112], kur maistas pasilieka ilgą laiką. Tyrėjai nustatė, kad transgeninė DNR yra greitai suskaidoma skysčių, išsiskiriančių iš didžiojo skrandžio ir siloso, tačiau vis dėlto horizontalus jos perkėlimas gali įvykti iki to momento, kai transgeninė DNR bus visiškai suskaidyta.

Jie taip pat nustatė, kad transgeninė DNR labai lėtai skyla seilėse ir todėl burna gali būti pagrindinė vieta, kur vyksta horizontalus genų perkėlimas. Tai patvirtino Mercerio ir kitų gautus rezultatus [111]. Tačiau ir vėl jokių tolesnių tyrimų su gyvais gyvūnais nebuvo atlikta. Ar tai buvo tas atvejis, kai vengiama atlikti akivaizdžius eksperimentus bijant, kad bus gauti teigiami rezultatai, kuriuos bus sunkiau atmesti?

Transgeninės DNR perkėlimas per žarnų sieneles ir placentą
Kaip paaiškėjo iš mokslinės literatūros, esama ir daugiau horizontalaus genų perkėlimo galimybių. XX a. paskutiniojo dešimtmečio pradžioje Döerflerio tyrėjų grupė Vokietijoje atliko seriją eksperimentų, kuriais buvo siekiama nustatyti maiste esančios svetimos DNR likimą.

Jie šėrė peles DNR, kuri buvo išskirta iš bakterijų viruso M13 arba į plazmidę įterpto žaliai fluorescuojančio baltymo klonuoto geno. Jie nustatė, kad nedidelė, tačiau reikšminga virusinės ir plazmidinės DNR procentinė dalis ne tik išvengė visiško suskaidymo žarnyne, bet sugebėjo pereiti per žarnų sieneles į kraujotakos sistemą, ir taip patekti į kai kuriuos baltuosius kraujo kūnelius, blužnies ir kepenų ląsteles, tapdama pelės ląstelių genomo dalimi [113]. Šeriant nėščias peles svetima DNR, buvo pastebėta, kad pastarąją galima aptikti kai kuriose embrionų ir pelių naujagimių ląstelėse, o tai rodo, kad ji perėjo per placentą [114].

Šiame darbe akcentuojami visų rūšių pavojai, susiję su „nuoga“ DNR, įskaitant genų inžinerijos pramonės sukurtus virusų genomus, į kuriuos atkreipė dėmesį Norvegijos virusologas ir mokslinis Norvegijos vyriausybės konsultantas Terje Traavikas [115], ir kiti mokslininkai [94, 95].

Döerfleris ir Schubbertas savo 1998 m. paskelbtame moksliniame darbe [114] teigė, kad „Svetimos DNR įsisavinimo pasekmės, susijusios su mutageneze (mutacijų atsiradimu) ir onkogeneze (vėžio atsiradimu) dar nėra ištirtos“. Šio teiginio aktualumas ypač stulbina, atsižvelgiant į vėžio atsiradimo atvejus, nustatytus genų terapijos recipientų tarpe 2002 m. antrajame pusmetyje [116]. Teiginys išreiškia mintį, kad nepaisant to, ar transgeninė DNR perkeliama genų terapijos keliu ar per GM maisto produktus, jos veikimo [gyviems organizmams] rizika yra ta pati. Genų terapija – tai žmonių genetinė modifikacija, kurios metodai labai panašūs į augalų ir gyvūnų genetinėms modifikacijoms naudojamas technikas.

Vengiama eksperimentų, galinčių pateikti galutinį atsakymą
2001 m. buvo paskelbta ataskaita [117], kurios tikslas – palyginti paprastų sojos pupelių DNR, išskirtos iš sojos pupelių lapų, ir transgeninės plazmidinės DNR likimą. Ji patvirtino ankstesnius rezultatus. Transgeninė plazmidinė DNR įsiskverbė į daugelio audinių ląsteles.

Tačiau, kaip ir dauguma apžvelgtų mokslo tyrimų projektų, pastarasis taip pat rodos nutrūko dar gerokai anksčiau prieš pradedant siekti aiškesnių, galutinių rezultatų, kuriuos būtų buvę nesunku gauti šeriant peles transgenine soja ir stebint abiejų DNR – transgeninės ir paties augalo DNR – tolesnį likimą. Tai būtų vienaip ar kitaip padėję spręsti hipotezę, kurią ne kartą kėlė Ho ir Cumminsas, kad transgeninė DNR gali pasižymėti didesnėmis invazinėmis savybėmis ląstelių ir genomų atžvilgiu nei natūrali DNR.

Iš tiesų, kaip teigia Ewensas [44], negalima atmesti ir galimybės, kad, šeriant gyvulius tokiais GM maisto produktais kaip kukurūzai, taip pat atsiranda rizika. Karvės piene gali būti GM derivatų ir net jautienos kepsnyje gali būti aktyvios GM medžiagos, nes DNR yra stebėtinai patvari ir net veikiama karščiu dažnai išlieka nesuirusi. Neseniai DNR buvo gauta iš 300 000–400 000 metų senumo dirvos nuosėdų [118]. Pranešama, kad Oksfordo universiteto vadovaujantis tyrėjas profesorius Alanas Cooperis savo pastarojo apsilankymo Naujojoje Zelandijoje metu pasakė [119]: „DNR sugebėjimas išlikti dirvoje tokį ilgą laiką buvo visiškai neįvertintas, ir tai parodo, kiek mažai žinome“, ir „turi būti atlikta žymiai daugiau tyrimų, iki bus galima numatyti GM augalų išleidimo į aplinką poveikį“.

Maiste esanti transgeninė DNR perėjo į žmogaus žarnyne gyvenančias bakterijas
Galiausiai Jungtinės Karalystės vyriausybė užsakė atlikti tyrimą, siekdama nustatyti horizontalaus genų perkėlimo į savanorių žmonių žarnyno bakterijas galimybę, ir gavo teigiamus rezultatus.

Minėtasis tyrimas yra paskutinė Jungtinės Karalystės Maisto standartų agentūros (angl. Food Standards Agency, FSA) projekto dėl rizikos, susijusios su GMO žmonių maisto produktuose, įvertinimo [120] dalis.

Tai, kad transgeninė DNR pereina į žmogaus žarnyno bakterijas, anaiptol nėra netikėta. Iš pirmiau apžvelgtų tyrimų jau žinome, kad DNR išlieka žarnyne ir kad bakterijos gali lengvai priimti svetimą DNR. Tai kodėl mūsų reguliuojančios institucijos tiek ilgai delsė užsakyti tą tyrimą? O kai užsakė, pasirodė, kad mokslininkai taip sukonstravo eksperimentą, kad viską sumaišytų ir negautų teigiamo rezultato [121].

Pavyzdžiui, transgeninės DNR nustatymo metodas buvo pagrįstas mažos dalelės, tesudarančios 180 bp (bazių porų) visos įterptos transgeninės DNR, kuri buvo mažiausiai dešimt ar dvidešimt kartų ilgesnė, amplifikacija. Taigi joks kitas įterptos sekos fragmentas nebūtų aptiktas, kaip ir fragmentas, kuris nesutapo su visa amplifikuota 180 bp seka ar kuris buvo pertvarkytas. Šiuo atveju tikimybė gauti teigiamą rezultatą yra geriausiu atveju 5 %, ir tikėtina, kad ji bus daug mažesnė. Taigi šiuo aptikimo metodu gautas neigiamas rezultatas greičiausiai neparodys, kad transgeninės DNR nėra.

Nepaisant to, vis tiek buvo gauti teigiami rezultatai, kuriuos FSA nedelsdama atmetė ir klaidingai pateikė. Teigiama, kad FSA tvirtino, jog „rezultatus įvertino keletas Vyriausybės ekspertų, kurie nusprendė, kad žmonėms rizikos nėra“. FSA savo interneto svetainėje paskelbtame pareiškime teigė, kad tyrimo metu prieita išvados, jog tikimybė, kad GM genai gali galiausiai atsidurti juos suvalgiusių žmonių žarnyne yra „be galo maža“.

Agrobakterijos vektorius – įrankis genams pernešti (angl. vehicle for gene escape)
Tai ne viskas – neseniai pateikti įrodymai leidžia manyti, kad dažniausiai pasitaikantis transgeninių augalų kūrimo metodas taip pat gali pasitarnauti kaip kelias horizontaliam genų perkėlimui [122, 123].

Agrobacterium tumefaciens, dirvožemio bakterija, sukelianti augalų bakterinį gumbą, tapo pagrindiniu genų perkėlimo vektoriumi, naudojamu kuriant transgeninius augalus. Paprastai svetimi genai yra įterpiami į agrobakterijos A. tumefaciens plazmidės dalį T-DNR, kuri vadinama Ti (angl. tumor inducing – sukelianti auglius), ir galiausiai jie integruojami į augalo ląstelės, kurioje po to išsivysto auglys, genomą. Tiek buvo žinoma bent jau nuo 1980 m.

Tačiau vėlesni tyrimai parodė, kad procesas, kurio metu agrobakterija A. tumefaciens įterpia T-DNR į augalo ląsteles, labai primena konjugaciją (genetinės medžiagos pernešimas esant kontaktui tarp dviejų ląstelių).

Konjugacijai, kuri vyksta tarpininkaujant tam tikroms bakterinėms plazmidėms, reikalinga DNR seka, vadinama pernešimo pradžios vieta (angl. origin of transfer, oriT). Visas kitas funkcijas gali atlikti kiti nesusiję faktoriai, vadinami tra (angl. trans-acting functions). Tokiu būdu „neveiklios“ plazmidės, neturinčios tra funkcijų, vis tiek gali būti perneštos plazmidžių „padėjėjų“, kurios turi tra funkcijas koduojančius genus. Tai sudaro sudėtingos vektorių sistemos, į kurią įeina agrobakterijos A. tumefaciens T-DNR, ir kuri naudojama kuriant daugelį transgeninių augalų, pagrindą.

Tačiau netrukus paaiškėjo, kad kairysis ir dešinysis T-DNR kraštai yra panašūs į oriT ir gali būti ja pakeisti. Dar daugiau, T-DNR, neturinčiai tra funkcijų (virulentiškumo genų, kurie padeda sukelti ligą) gali pagelbėti panašūs genai, priklausantys daugeliui kitų patogeninių bakterijų. Atrodo, kad ir Agrobacterium tumefaciens genų perkėlimas tarp skirtingų karalysčių, ir konjugaciniai bakterijų mechanizmai – ne vien tik DNR, bet ir baltymai – dalyvauja pernešant makromolekules.

Tai reiškia, kad transgeniniai augalai, sukurti naudojant T-DNR vektorių sistemą, turi jau paruoštą horizontalaus genų perdavimo (angl. horizontal gene escape) mechanizmą per Agrobacterium, kurio veikimui padeda daugelio kitų ligas sukeliančių aplinkos bakterijų paprasti konjugaciniai mechanizmai.

Iš tikrųjų, hipotezė, kad Agrobacterium gali pasitarnauti kaip horizontalaus genų perdavimo įrankis, pirmą kartą buvo iškelta 1997 m. paskelbtame moksliniame darbe, kurį finansiškai parėmė Jungtinės Karalystės vyriausybė [124]. Šiame darbe teigiama, kad, įvykus transformacijai, vektorių sistemoje labai sunku atsikratyti agrobakterijos A. tumefaciens. Šios bakterijos atsikratyti nepavyko net 13 mėnesių naudojant antibiotikų arsenalą ir pakartotinę subkultūrą. Be to, 12,5 % išlikusių agrobakterijų A. tumefaciens vis dar turėjo dvinarį vektorių (T-DNR ir plazmidę „padėjėją“) ir todėl buvo visiškai pajėgios transformuoti kitus augalus. Šis tyrimas vėliau buvo paskelbtas moksliniame žurnale [125].

Keletas kitų stebėjimų padaro genų perdavimą per Agrobacterium dar labiau tikėtiną. Agrobakterija A. tumefaciens ne tik perneša genus į augalo ląsteles; yra galimybė perkelti DNR iš augalo ląstelės į agrobakteriją [126].

Didelė genų perkėlimo tikimybė yra siejama su augalo šaknų sistema ir dygstančia sėkla, kur konjugacijos tikimybė yra didžiausia [127]. Ten Agrobacterium galėtų daugintis ir perduoti transgeninę DNR kitoms bakterijoms, taip pat ir kitiems augalams, kurie bus sėjami. Šios galimybės dar turi būti ištirtos empiriškai.

Galiausiai agrobakterija prisitvirtina ir genetiškai transformuoja keletą žmogaus ląstelių linijų [128]. Stabiliai transformuotose HeLa ląstelėse (žmogaus ląstelių linija, pradžioje išgauta iš vėžiu sergančio ligonio) T-DNR integracija įvyko prie dešiniojo krašto, lygiai taip, kaip būtų atsitikę, perkeliant ją į augalo ląstelės genomą. Tai leidžia manyti, kad mechanizmas, kuriam veikiant agrobakterija transformuoja žmogaus ląsteles, yra panašus į tą, kuriuo ji transformuoja augalų ląsteles.